KAROTEENIVÄRIAINEIDEN
ERISTÄMINEN JA ANALYSOINTI
Tässä työssä käytetään
seuraavia menetelmiä, jotka ovat aika vaativia.
- liuotinutto keittämällä
palautusjäähdyttäjän alla
- imusuodatus
- liuottimen poisto pyöröhaihduttimella (tai vakuumitislauksella)
- aineen puhdistaminen adsorptioon perustuen SPE-pylväällä
- absorptiospektrin mittaus spektrofotometrillä
Työn tarkoitus on määrittää
karoteeniväriaineet tomaatista, porkkanasta ja pinaatista.
Karotenoidit ja klorofyllit
ovat kasvien väriaineita. Niitä löytyy hedelmistä ja vihanneksista,
esimerkiksi tomaatista, pinaatista ja porkkanoista. Niitä löytyy myös
kasvien lehditä, tosin tällöin ne peittyvät yleensä muiden väriaineiden
alle. Karotenoidit ovat väriltään punaisia, keltaisia tai oransseja.
Yleisimmät karotenoidit ovat lykopeeni ja
ß-karoteeni,
jotka ovat A-vitamiinin esiasteita. Tiettyjen aallonpituuksien
absorbointi kyky näkyvästä valosta mahdollistaa kasvupigmenttien
värillisyyden. Absorptiokyky puolestaa on riippuvainen aineen
rakennekomponenteista, karotenoidien tapauksessa kaksoissidosten π-
sidokset ovat absoboiva rakenneosa.
Työn
suoritus:
Karotenoidien uuttaminen
Kaikki käsittelyt suoritataan
mahdollisuusksien mukaan vetokaapissa.
Tomaatti ja
porkkana:
Otetaan kolme teelusikallista
tomaattisosetta tai n. puolikas raastettua porkkanaa (n. 10g) isolla
hioksella varstettuun 250 ml:n kolviin, lisätään 25 ml metanolia ja 50
ml dikloorimetaania (CH2Cl2) ja keitetään
pystyjäähdyttäjän alla sähköhauteessa n. 5 min (katso mallikuva
laitteesta). Suodatetaan seos imusuodatuksella ja otetaan suodos
talteen. ”Sakka” palautetaan kolviin ja uutetaan uudelleen 50 ml:lla
dikloorimetaania n. 5 min ajan pystyjäähdyttäjän alla. Jäähdytetään ja
suodatetaan imulla. Suodokset yhdistetään erotussuppiloon ja ”sakka”
heitetään pois. Yhdistetty suodos pesään kahteen kertaan vedellä (n. 50
ml) varovasti ravistellen. Dikloorimetaani on vettä raskaampaa, joten
talteen otetaan pesuissa alempi orgaaninen kerros ja ylempi vesikerros
heitetään pois. Mikäli kerrosten erottuminen on vaikeaa, lisätään
emulsioon NaCl- suolaa. Orgaaninen faasi kaadetaan erlenmeyerkolviin ja
kuivataan vedettömällä natriumsulfaatilla.
Liuos kaadetaan 100 ml:n
kolviin ja liuotin poistetaan kokonaan pyöröhaihduttimella
(rotavaporilla tai onnistuu myös tislauslaitteistolla). Jäännös
liuotetaan 10 ml:aan heksaania (heksaanin ja asetonin seos tai
petrolieetteriä).
Pinaatti:
¼ pakettia pakastepinaattia (n.
30g) murskataan huhmaressa 30-40 ml:aan metanolia. Metanoliliuos
puristetaan pinaatista mahdollisimman tarkkaan ja heitetään pois. Jauhetaan
pinaattia liuotinseoksessa, jossa on 20 ml metanolia
ja 30 ml petrolieetteriä (myös heksaanin ja asetonin seos käy
nähtävästi, kunhan kiehumispiste on 40-60 *C). Suodatetaan seos
jauhosuppilossa olevan vanutupon läpi erotussuppiloon. Pinaattia
jauhetaan vielä uudelleen liuotinseoksessa, jossa on 15 ml metanolia ja
45 ml petrolieetteriä ja tämän jälkeen suodatetaan erotussuppiloon. Nyt
suurin osa pinaatissa olevasta vedestä on liuennut metanolifaasiin ja
pääaso orgaanisesta pigmenteistä petrolieetteriin. Erotussuppilossa
oleva alempi kerros (metanolikerros) voidaan heittää pois, mutta
varmuuden vuoksi se tulee kuitenkin säilyttää työn loppuun asti
sivummalla suljetussa astiassa. Petrolieetterikerros pestään pariin
kertaan vedellä (noin 50 ml). Erotussuppiloa heilutellessa tulee
huomioida erityisesti turvallisuus ja noudatettava erityistä
huolellisuutta. Mikäli rasvistellessa syntyy emulsio, hajoitetaan se
lisäämällä suppiloon NaCl- suolaa. Petrolieetterin vesipesujen
tarkoituksena on poistaa liuennut metanoli. Pesty petrolieetteriliuos
kaadetaan esimerkiksi 150 ml:n erlenmeyerkolviin ja kuivataan 1- 2 g:lla
vedetöntä natriumsulfaattia. Suodatetaan liuos 100 ml:n kolviin ja
poistatetaan liuotin esimerkiksi pyöröhaihduttimella tai
vakuumitislauksella. Jäännös liuotetaan 10 ml:aan petrolieetteriä (tai
muuhun vastaavaan, kuten jo edellä on tehty).
Uutteiden puhdistaminen adsorptioon
(perustuen SPE-pylväässä)
SPE-pylvään valmistus:
Alumiinioksidipylväs (Al2O3)
kiinnitetään pystyasentoon statiiviin ja sen alapuolelle asetataan 10
ml:n kierrokorkkiputki. Pylväs aktivoidaan heksaanilla. Pylvään päälle
pipetoidaan 5 ml heksaania ja annetaan sen kulkea alumiinioksidipatsaan
läpi.
Karotenoidien puhdistaminen
adsorptiopylväässä
Alumiinioksidipylvään alle
vaihdetaan uusi, puhdas putki, johon karotenoidit kerätään. Pipetoidaan
2 ml kasvipigmenttiseosta pylvääseen ja annetaan sen imeytyä sekä
kulkeutua pylvään läpi. Muista tarkailla samalla, mitä pylväässä
tapahtuu. Varmistetaan karotenoidien eluoituminen
alumiinioksidipylväästä pipetoimalla pylvääseen vielä 3 ml
heksaani-asetoniliuosta ja antamalla sen kulkeutua alumiinioksidipatsaan
läpi. Karotenoidit ovat nyt eluoituneet. Vaihdetaan
alumiinioksidipylvään alle klorofyllien keräysputki. Klorofyllit
vapautetaan alumiinioksidipylväästä 3 ml:lla asetonia ja kerätään
eluentti talteen. Miltä pylväs näyttää eluution jälkeen?
UV/VIS spektrin ajaminen
Jokaisesta kasviuutteesta ajetaan
absortiospektri Perkin- Elmer spektrofotometrillä VIS-alueella 350-550
nm. Verrataan ajettuja spektrejä oheisiin lykopeenin ja B-karoteenin
spektreihin ja päätellään spektrikuvan ja siinä olevien
absorptiomekanismien perusteella, mikä on kunkin kasvin
pääkaroteenikomponentti. Ajetaan lisäksi klorofyllin absorptiospektri
VIS-alueella 400-800 nm.
|