KAROTEENIVÄRIAINEIDEN ERISTÄMINEN JA ANALYSOINTI

Tässä työssä käytetään seuraavia menetelmiä, jotka ovat aika vaativia.

- liuotinutto keittämällä palautusjäähdyttäjän alla
- imusuodatus
- liuottimen poisto pyöröhaihduttimella (tai vakuumitislauksella)
- aineen puhdistaminen adsorptioon perustuen SPE-pylväällä
- absorptiospektrin mittaus spektrofotometrillä

Työn tarkoitus on määrittää karoteeniväriaineet tomaatista, porkkanasta ja pinaatista.

Karotenoidit ja klorofyllit ovat kasvien väriaineita. Niitä löytyy hedelmistä ja vihanneksista, esimerkiksi tomaatista, pinaatista ja porkkanoista. Niitä löytyy myös kasvien lehditä, tosin tällöin ne peittyvät yleensä muiden väriaineiden alle. Karotenoidit ovat väriltään punaisia, keltaisia tai oransseja. Yleisimmät karotenoidit ovat lykopeeni ja ß-karoteeni, jotka ovat A-vitamiinin esiasteita. Tiettyjen aallonpituuksien absorbointi kyky näkyvästä valosta mahdollistaa kasvupigmenttien värillisyyden. Absorptiokyky puolestaa on riippuvainen aineen rakennekomponenteista, karotenoidien tapauksessa kaksoissidosten π- sidokset ovat absoboiva rakenneosa.

Työn suoritus:

Karotenoidien uuttaminen

Kaikki käsittelyt suoritataan mahdollisuusksien mukaan vetokaapissa.

Tomaatti ja porkkana:

Otetaan kolme teelusikallista tomaattisosetta tai n. puolikas raastettua porkkanaa (n. 10g) isolla hioksella varstettuun 250 ml:n kolviin, lisätään 25 ml metanolia ja 50 ml dikloorimetaania (CH₂Cl₂) ja keitetään pystyjäähdyttäjän alla sähköhauteessa n. 5 min (katso mallikuva laitteesta). Suodatetaan seos imusuodatuksella ja otetaan suodos talteen. ”Sakka” palautetaan kolviin ja uutetaan uudelleen 50 ml:lla dikloorimetaania n. 5 min ajan pystyjäähdyttäjän alla. Jäähdytetään ja suodatetaan imulla. Suodokset yhdistetään erotussuppiloon ja ”sakka” heitetään pois. Yhdistetty suodos pesään kahteen kertaan vedellä (n. 50 ml) varovasti ravistellen. Dikloorimetaani on vettä raskaampaa, joten talteen otetaan pesuissa alempi orgaaninen kerros ja ylempi vesikerros heitetään pois. Mikäli kerrosten erottuminen on vaikeaa, lisätään emulsioon NaCl- suolaa. Orgaaninen faasi kaadetaan erlenmeyerkolviin ja kuivataan vedettömällä natriumsulfaatilla.

Liuos kaadetaan 100 ml:n kolviin ja liuotin poistetaan kokonaan pyöröhaihduttimella (rotavaporilla tai onnistuu myös tislauslaitteistolla). Jäännös liuotetaan 10 ml:aan heksaania (heksaanin ja asetonin seos tai petrolieetteriä).

Pinaatti:

¼ pakettia pakastepinaattia (n. 30g) murskataan huhmaressa 30-40 ml:aan metanolia. Metanoliliuos puristetaan pinaatista mahdollisimman tarkkaan ja heitetään pois. Jauhetaan pinaattia liuotinseoksessa, jossa on 20 ml metanolia ja 30 ml petrolieetteriä (myös heksaanin ja asetonin seos käy nähtävästi, kunhan kiehumispiste on 40-60 *C). Suodatetaan seos jauhosuppilossa olevan vanutupon läpi erotussuppiloon. Pinaattia jauhetaan vielä uudelleen liuotinseoksessa, jossa on 15 ml metanolia ja 45 ml petrolieetteriä ja tämän jälkeen suodatetaan erotussuppiloon. Nyt suurin osa pinaatissa olevasta vedestä on liuennut metanolifaasiin ja pääaso orgaanisesta pigmenteistä petrolieetteriin. Erotussuppilossa oleva alempi kerros (metanolikerros) voidaan heittää pois, mutta varmuuden vuoksi se tulee kuitenkin säilyttää työn loppuun asti sivummalla suljetussa astiassa. Petrolieetterikerros pestään pariin kertaan vedellä (noin 50 ml). Erotussuppiloa heilutellessa tulee huomioida erityisesti turvallisuus ja noudatettava erityistä huolellisuutta. Mikäli rasvistellessa syntyy emulsio, hajoitetaan se lisäämällä suppiloon NaCl- suolaa. Petrolieetterin vesipesujen tarkoituksena on poistaa liuennut metanoli. Pesty petrolieetteriliuos kaadetaan esimerkiksi 150 ml:n erlenmeyerkolviin ja kuivataan 1- 2 g:lla vedetöntä natriumsulfaattia. Suodatetaan liuos 100 ml:n kolviin ja poistatetaan liuotin esimerkiksi pyöröhaihduttimella tai vakuumitislauksella. Jäännös liuotetaan 10 ml:aan petrolieetteriä (tai muuhun vastaavaan, kuten jo edellä on tehty).

Uutteiden puhdistaminen adsorptioon (perustuen SPE-pylväässä)

SPE-pylvään valmistus:

Alumiinioksidipylväs (Al₂O₃) kiinnitetään pystyasentoon statiiviin ja sen alapuolelle asetataan 10 ml:n kierrokorkkiputki. Pylväs aktivoidaan heksaanilla. Pylvään päälle pipetoidaan 5 ml heksaania ja annetaan sen kulkea alumiinioksidipatsaan läpi.

Karotenoidien puhdistaminen adsorptiopylväässä

Alumiinioksidipylvään alle vaihdetaan uusi, puhdas putki, johon karotenoidit kerätään. Pipetoidaan 2 ml kasvipigmenttiseosta pylvääseen ja annetaan sen imeytyä sekä kulkeutua pylvään läpi. Muista tarkailla samalla, mitä pylväässä tapahtuu. Varmistetaan karotenoidien eluoituminen alumiinioksidipylväästä pipetoimalla pylvääseen vielä 3 ml heksaani-asetoniliuosta ja antamalla sen kulkeutua alumiinioksidipatsaan läpi. Karotenoidit ovat nyt eluoituneet. Vaihdetaan alumiinioksidipylvään alle klorofyllien keräysputki. Klorofyllit vapautetaan alumiinioksidipylväästä 3 ml:lla asetonia ja kerätään eluentti talteen. Miltä pylväs näyttää eluution jälkeen?

UV/VIS spektrin ajaminen

Jokaisesta kasviuutteesta ajetaan absortiospektri Perkin- Elmer spektrofotometrillä VIS-alueella 350-550 nm. Verrataan ajettuja spektrejä oheisiin lykopeenin ja B-karoteenin spektreihin ja päätellään spektrikuvan ja siinä olevien absorptiomekanismien perusteella, mikä on kunkin kasvin pääkaroteenikomponentti. Ajetaan lisäksi klorofyllin absorptiospektri VIS-alueella 400-800 nm.