KOFEIININ NESTEKROMATOGRAFINEN MÄÄRITYS
HUOM! Jos koulussasi ei ole tarvittavaa laitteistoa, työ on mahdollista suorittaa esimerkiksi
Helsingin Yliopistolla, joka ottaa mielellään vastaan opiskelijaryhmiä. Voit kysyä vierailumahdollisuutta
myös oman paikkakuntasi laboratorioista, esimerkiksi terveyskeskuksen laboratoriosta.
1. SOVELTUVUUS
Menetelmä soveltuu kofeiinin määritykseen niin kiinteästä kuin nestemäisistä näytteistä
edellyttäen, että kofeiini on kromatografisesti erotettavissa näytteen muista yhdisteistä.
2. PERIAATE
Kofeiini liuotetaan/uutetaan metanoliin. Tästä liuoksesta määritetään kofeiini nestekromatografisesti
käänteisfaasikolonnilla ja UV-detektorilla käyttäen ulkoisen standardin menetelmää (=ESTD).
3. ANALYYSIAIKA
kromatografointi 10 min./1 näyte
4. REAGENSSIT
* metanoli, p.a.
* vesi, ionivaihdettu
* fosforihappo, p.a.
* kofeiini
5. TARVIKKEET
* Nestekromatografi, esim. Merck Hitachi
* Integraattori, esim. Merck Hitachi D-2000
* 100 ml:n mittapulloja
* pipettejä
* ks. nestekromatografointi alla
6. SUORITUS
Standardiliuoksen teko:
1. Punnitse tarkasti 50 mg kofeiinia 100 ml:n mittapulloon, jossa on n. 20 ml metanolia.
2. Anna liueta.
3. Täytä pullo 100 ml:ksi metanolilla.
4. Pipetoi 10 ml edellä tehtyä standardiliuosta toiseen mittapulloon, täytä 100 ml:ksi
metanolilla. = injektoitava standardiliuos
Näyteliuoksen teko:
1. Pipetoi 10 ml valmista kahvi- tai teejuomaa 100 ml:n mittapulloon.
2. Täytä 100 ml:ksi metanolilla.
3. Suodata injektointia varten muutama millilitra 0,45 mm:n suodattimen läpi.
4. Jos käytät Cola-juomaa, anna hiilihapon ensin poistua ja toimi muuten kuten edellä.
Nestekromatografointi:
kolonni RPS - 18,7 mm, 25 cm x 0,46 cm
detektori 273 nm
virtaus 2 ml/min.
herkkyys att 6
injektointi 0,01 ml
eluentti A = vesi, jossa on 0,5 ml fosforihappoa/litra vettä
C = metanoli
eluentin ajo-olosuhteet A % = 70 C % = 30
7. TULOSTUS
Tulostus ESTD-menetelmällä, käyttäen integrointiin piikkien pinta-aloja.
LASKU: kofeiini-pitoisuus mg/dl =
An x Cst x lk
Ast
An = näytepiikin pinta-ala
Cst = standardin pitoisuus mg/dl (=mg/100 ml)
Ast = standardipiikin pinta-ala
lk = laimennuskerroin (esim. kahvi 10, cola 2)
8. HUOMAUTUKSIA
- Injektiotilavuuden on oltava tarkka johtuen ESTD-menetelmästä.
- Injektointi vähintään kaksi kertaa/näyte
- Kofeiinin absorptiomaksimi 273 nm
- Pienin mitattavissa oleva kofeiinimäärä tällä menetelmällä on n. 0,02 mg/dl.
- Keskivahva kahvi sisältää kofeiinia 70 - 80 mg/dl, Pepsi-Cola n.10 mg/dl.
- LUE METANOLIN KÄYTTÖTURVALLISUUSTIEDOTE!